Vilém Pfeiffer pochází z Prahy, ale dětství strávil s rodiči v Bratislavě. Podporován matkou, jinak nadšenou ochotnicí, od dětství hrával divadlo, později také v dramatickém kroužku Intimní divadlo. Na popud režiséra Jana Svitáka se vydal na hereckou dráhu; opustil nedokončené gymnázium a od roku 1927 hrál osm let u kočovných divadelních společností (Z. Melíšek, A. Brázdová, J. Bittl). V polovině 30. let pak získal angažmá na avantgardní scéně D 34 E. F. Buriana (1935-1937), kde jeho herectví dostalo zcela nový rozměr. Tady vynikl v dramatizacích děl K. H. Máchy Máj nebo Kat a díky těmto hereckým vystoupením také poprvé zaujal filmaře. V letech 1937-1939 hostoval v Národním divadle, na počátku okupace odešel na oblastní scény (Kladno 1939-1941, Plzeň 1941-1943), pak se znovu vrátil do Prahy a během pěti let vystřídal řadu scén, kde působil nejen herecky, ale později i jako režisér (Intimní divadlo, Nezávislé divadlo, po válce pak Divadlo kolektivní tvorby, Lidová činohra, Divadlo města Žižkova a Armádní umělecký soubor Víta Nejedlého). Na popud svého přítele, režiséra Antonína Kurše, odešel po roce 1948 znovu mimo Prahu, hrál ve Státním divadle v Ostravě (1948-1953), kde spolupracoval také s amatérským divadlem, dále hrál v Městském divadle v Benešově (1953-1955) a v Horáckém divadle v Jihlavě (1955-1959). Posledních šestnáct let své herecké dráhy strávil na jevišti Divadla bratří Mrštíků v Brně (1959-1975), v roce 1975 pak odešel do důchodu. Na jevištích různých divadel ztvárnil řadu velkých postav světového i domácího repertoáru, od počátečních milovníků se přehrál do dramatických a charakterních úloh, jejichž společným prvkem byla vždy snaha o věrohodné pojetí a procítěnost ve spojení s civilním hereckým projevem. V Brně vynikl v moderních hrách typu Od noci k ránu, Nedohledné dálky nebo Korczak a děti, uplatnil se ale i v klasickém repertoáru (Maryša, Bouře, Nápadníci trůnu, Othello, Strýček Váňa). I po odchodu na odpočinek nadále pohostinsky hrál a na scéně Divadla bratří Mrštíků nakonec ještě krátce před smrtí hrál v Richardovi II.
Po roce 1945 význam i pokles Pfeifferových rolí ve filmu výrazně poklesl, ještě v letech 1946-1947 hrál celkem v šesti filmech, se svým odchodem mimo Prahu pak v 50. letech spolupráci s filmem přerušil na dvacet let. V poválečných filmech byl nejčastěji pověřen úlohami četníků nebo policistů (NIKOLA ŠUHAJ, 1947; ULOUPENÁ HRANICE, 1947; ČAPKOVY POVÍDKY, 1947; FRONA, 1954). Až po odchodu ze stálého divadelního angažmá byl osloven Karlem Kachyňou a ztvárnil hlavní roli v sociálním dramatu ze třicátých let ŠKAREDÁ DĚDINA (1975). Přes letitou odmlku ve filmu prokázal znovu své herecké schopnosti před kamerou a následně se objevil v několika dalších titulech. Jeho poslední rolí byla postava chromého dědy Jonáše ve filmu KONEČNÁ STANICE (1981).
Vilém Pfeiffer zemřel v Brně 31. ledna 1986 ve věku 75 let. Jeho manželkou byla herečka Lola Skrbková (1902-1978), s níž se seznámil v angažmá u E. F. Buriana.